Yeni Nesil CRISPR Düzenleme Aracı: “Prime Editing”

30 Kasım 2019 7 dk okunma süresi

2012 yılı itibariyle geliştirilmeye başlanan CRISPR-Cas gen düzenleme sisteminin, geçen yedi yılda birçok yeni nesil versiyonları üretildi. Ancak şimdiye kadar bu sistemin hiçbir versiyonu, "Prime Editing" (PM) adı verilen yeni gen düzenleme teknolojisi kadar heyecan vermedi. CRISPR-Cas, çift sarmallı DNA'yı genomdaki istenen herhangi bir hedef konumdan keserek, DNA çift zincir kırılımına (double strand brake) yol açmaktadır. Böylece hedef bölgenin mutasyona uğraması (insertion-deletion) veya mutasyonlu bölgenin işlevsel hale dönüştürülmesi için hücre onarım mekanizmalarının (Homolog olmayan uç birleşimi: Non homologous end joining, NHEJ; homoloji odaklı onarım: homology directed repair, HDR) aktifleşmesini sağlar. Ancak CRISPR-Cas, çoğu zaman istenmeyen hedef dışı mutasyonlar (off-target) oluşturduğundan ötürü, araştırmacılar bu sistemin açıklarını hackleme yoluna sıklıkla gidiyorlar. “Prime Editing” işte bu gayretin sonucunda ortaya çıkan “şimdilik” en etkili ve en iddialı gen düzenleme araçlarından biri olarak duyuruldu [1].

 

CRISPR-Cas'ın temel bileşenlerini içeren bu yeni nesil sistem, bahsedilen bu sorunların üstesinden gelebilir. Sebeplerinden ilki, PM teknolojisi DNA çift sarmalını tamamıyla kesmez, ancak Cas enziminin tarama özelliğinden yararlanarak hedeflenen bölgeden DNA'ya tutunarak tek zincirde bir "çentik" (nick) açar. CRISPR-Cas makinesi, düzeltilmesi istenen diziyi daha sonra, rehber RNA dizisini okuyabilen ve onu çentiğin açıldığı bölgeye işleyebilen bir enzime, (reverse transkriptase)’a aktararak oligo yardımcı DNA gerektirmeden bölgenin tekrar düzeltilmesini sağlar. Massachusetts (Boston)’in Broad Institute’daki Dr.David Liu’nun ekibinin geliştirdiği “Prime Editing” sistemi ile ilgili çalışma, Nature’da yayınlandı. 175’ten fazla insan ve fare hücre çeşidinde bu sistemin istendiği gibi çalıştığı açıklandı [2].

 

Daha önce nükleazlar ve baz editörleri kullanan genom düzenleme yöntemleri, çoğu hücre tipinde bu değişkenlerin sadece azınlığını düzeltme potansiyeline sahipti. Ancak PM teknolojisi genetik hastalıkların çoğunun düzeltilebileceğini iddia ediyor. İnsanlarda tanımlanmış ve ClinVar veritabanında kataloglanmış 75.000'in üzerinde patojenik genetik varyant var. Ancak Dr. David Liu’ya göre, PM teknolojisinin etkinliği gösterildikçe genetik hastalıkların % 89'unun bu sistemle daha kolay ve hızlı bir şekilde düzeltebilir. Tabi bu güçlü iddia, öncelikle kanıtlanması gerektiğinden hastalara umut vermemek adına tartışmalara da sebep oldu.  Bu sebeple PM, genetik kodu doğru bir şekilde yeniden yazabildiğinden ötürü bir "genetik kelime işlemcisi" olarak tanımlanıyor. Diğer %11 bir mutasyon çeşidi ise halen tamir edilmeyi bekleyen, bir genin çok fazla kopyası olduğu veya bütün bir genin eksik olduğu durumları içerdiğinden hala çözülmesi beklenen bir sorun. Yine de Dr. Liu, "PM teknolojisi, moleküler yaşam bilimlerinde, genetik hastalıkları olan potansiyel insan hastaları da dahil olmak üzere, canlı bir hücre ya da organizmanın herhangi bir pozisyonunda herhangi bir DNA değişikliği yapabilmek için uzun zamandır devam eden bir arzunun ürünüdür" diyor.

 

Yeni Nesil CRISPR Gen Düzenleme Aracı “Prime Editing”,

Genetik Hastalıkların %89'unu Düzeltebilir! [3]

 

“Prime Editing” Nasıl Çalışıyor?

Hedeflenen eklemelere, silmelere ve tüm olası tabandan tabana dönüşümlere aracılık eden genom düzenleme tekniklerinin tümü, çift sarmallı DNA kırılımları (DSB'ler) veya donör DNA şablonları olmadan mümkün değil. Ancak PM teknolojisi, yüksek hassasiyet ve esnekliğiyle bu şartlara gereksinim duymadan istenen bölgenin düzeltilmesini sağlıyor. İlk önce, hem hedef bölgeyi belirleyen hem de istenen düzenlemeleri içeren tasarlanmış “birincil düzenleme rehber RNA” (prime editing guide RNA, pegRNA), editör Cas-RT proteinine bağlanır. Bu primer editör proteini, DNA’da çentik oluşturan Cas9 proteininden ve reverse transkriptaz (RT) proteininin birleştirilmesinden oluşuyor. Proteinin Cas9 nickaz kısmı, pegRNA tarafından DNA hedef bölgesine yönlendirilir. Cas9 tarafından hedef DNA zinciri çentiklendikten sonra, RT protein bölümü, istenen düzenlemenin transkripsiyonunu şablonlamak için pegRNA’yı DNA dizisine çevirerek kullanır ve DNA'yı doğrudan çentikli hedef DNA zinciri üzerine polimerize eder. Böylece, düzenlenen DNA çift zinciri, bir tamir edilmiş DNA dizisinden ve bir düzenlenmemiş diziden oluşan heterodubleks bir yapıya dönüştürülür. Son olarak, editör Cas9-RT, yapılan düzenlemeyi düzenlenemeyen diğer iplikçiye kopyalamak için heterodubleks bölümü yönlendirir ve istenen dizi hedef bölgeye işlenmiş ve mutasyonlu bölge düzeltilmiş olur [4].

Prime Editing ile bir genetik düzenleme yapmaya başlamak için aşağıdaki linki tıklayıp Dr.David Liu’nun plazmid DNA’larını temin edebilirsiniz!

 https://www.addgene.org/browse/article/28206799/

 

Prime Editing, HDR Tabanlı Tamirden Daha Başarılı!

Çift zincir DNA kırılımı (DSB) ile uyarılan Homoloji odaklı onarım (HDR), kesin değişiklikler oluşturmak için yaygın olarak kullanılmaya devam ediyor. Bununla birlikte, Cas9 nükleazının DSB oluşturma etkinliği nispeten HDR etkinliğinden daha yüksektir. Bu, çoğu Cas9 ile indüklenen DSB'lerin, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile onarıldığı ve gen düzenlenmesi yerine gende ekstra mutasyonlar (in-del) oluşturduğu anlamına geliyor. Sonuç olarak, HDR'nin gen tamir etkinliği tipik olarak %10'dan az olduğu çalışmalarda görülmüştür. Buna karşılık, Prime editing, HEK293T hücrelerinde ~% 20-50 gen düzenleme verimliliği sağladığı tespit edilmiştir.  Henüz “hastalıkların kalıcı çözümünü kolaylaştırdığı” iddiası, pre-klinik hayvan ve klinik hasta denemeleri olmadan için çok erken olduğu söylenebilir. Yine de genetik mühendislik teknolojileri gün geçtikçe daha kesin ve etkili çözüm yolları sunmaya devam ediyor. Bu alanda kurulan girişimler ve yapılan yatırımlar, geleceğin milyarlarca dolar büyüklüğündeki yeni bir pazarın ilk ışıklarını gösteriyor. Her şeyden önemlisi, halk tabiriyle “tedavisi imkansız” sanılan yedi bini aşkın nadir hastalığa sahip dünya üzerindeki 65 milyon ülkemizde ise 8 milyon insan için umut ışıkları gün geçtikçe artmaya devam ediyor.

 

Cihan Taştan, PhD

HiDNA (DNA’da Dijital Veri Depolama), Kurucu Ortağı

HiGen (Genetik Hastalıklara AAV Virüs Tedavisi), Kurucusu

ArGe Sorumlusu, Acıbadem Labcell Hücre Laboratuvarı

PhD, New York Üniversitesi

BSc, ODTÜ

 

KAYNAKÇA

  1. Cohen, J. (2019). Prime editing promises to be a cut above CRISPR.
  2. Anzalone, A.V., Randolph, P.B., Davis, J.R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1711-4
  3. Gallagher, J. Prime editing: DNA tool could correct 89% of genetic defects. BBC News Health
  4. Tseng, J. Prime Editing: Adding Precision and Flexibility to CRISPR Editing. Addgene Blog